Embriyoloji Laboratuvarı

Yumurta toplama (OPU) işleminden başlayarak embriyo transferine kadar geçen süreçte tüm uygulamalar, kadın vücudu dışında (in vitro) rahime eşdeğer bir ortamın sağlandığı Embriyoloji Laboratuvarı’nda gerçekleştirilir.Yumurtanın sperm ile döllenmesi sonucu oluşan embriyo, her iki gamet hücresinin kalitesine bağlı olarak belirli bir gelişim potansiyeline sahiptir. Bu potansiyel tamamen gamet hücreleri tarafından belirlenir ve döllenme sonrası dışarıdan yapılacak herhangi bir müdahale ile olumlu yönde bir değişim sağlamak mümkün değildir.


 

Laboratuvar kalitesi önemli


Embriyoloji Laboratuvarı’nın önemi bu noktada ortaya çıkar. Çünkü eğer laboratuvar uygun personel, donanım ve çevresel şartlara sahip değil ise bu potansiyeli olumsuz etkileme ihtimali yüksektir. Dolayısıyla çiftlerin merkez seçimlerinde laboratuvar kalitesi hakkında bilinçli olması başarı için hayati önem taşır.
 

Embriyoloji Laboratuvarı’nda uygulanan rutin işlemler

  • Yumurta toplama (OPU)
  • Denudasyon (Yumurta hazırlığı)
  • Döllenme (Fertilizasyon)
  • Embriyo kültürü
  • Assisted hatching (AHA)
  • Embriyo biyopsisi (Preimplantasyon genetik tanı-tarama)
  • Embriyo transferi
  • Embriyo dondurma
 

Yumurta Toplama-OPU (Oocyte Pick-up)


Yumurta toplama işleminde embriyoloji laboratuvarının görevi, hekim tarafından aspire edilen (foliküle iğne ile girilip çekilen) folikül sıvılarının steril çalışma kabini içerisindeki mikroskop altında içerisindeki yumurtaların toplanmasıdır. Laboratuvara gelen oositler (yumurta hücreleri) vücut ısısında kalacak şeklide toplanır ve kültür sıvılarının içerisine alınarak etrafındaki hücrelerin ayrılmasını sağlayacak denüdasyon işlemine kadar 3 saat bekletilir.

Yumurta toplanan ve o güne kadar ultrason ile büyümeleri gözlenen foliküllerin tümünün içinden yumurta hücresi çıkmayabilir. Takipler esnasında hastaya belirtilen folikül sayısı ile laboratuvarda toplanan yumurta sayısı arasındaki farklılıklar bundan kaynaklanabilir.
 

Denudasyon (Yumurta Hazırlığı)


OPU işleminde toplanan yumurtalar, COC (Cumulus oocyte complex) olarak tanımlanan yumurtanın gelişim aşamasında ve fertilizasyona kadarki süreçte gelişimini ve canlılığını destekleyen binlerce kümülüs hücresi ile çevrilidir. Eğer mikroenjeksiyon (ICSI) planlanıyor ise, olgun yumurtaların ve yumurta kalitelerinin tanımlanabilmesi için kümülüs hücreleri denudasyon olarak tanımlanan bir işlem ile yumurtadan ayrılır. Yapılan mikroskobik değerlendirmede olgun ve olgun olmayan yumurtalar tespit edilerek, mikroenjeksiyon işlemine kadar bekletilecekleri kültür sıvılarına alınır ve gerekli ortam koşullarını sağlayan inkübatörlere kaldırılır. Toplanan yumurtalardan sadece olgunluğunu tamamlamış (Metafaz 2 - M2) hücrelere işlem uygulanır. Bu nedenle her toplanan yumurta hücresine işlem yapılamayabilir.
 

Döllenme (Fertilizasyon)


Embriyoloji laboratuvarlarında, yumurtanın sperm ile döllenmesini sağlamak amacıyla IVF ve ICSI olarak adlandırılan iki farklı yöntem kullanılır:
 

IVF (In vitro Fertilization)


Tüp bebek tedavilerinde döllenmeyi sağlamak amacıyla kullanılan ilk yöntem olup, ilk olarak 1978 senesinde fizyolog Robert Edwards tarafından İngiltere’de başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntemde, androloji laboratuvarı tarafından hazırlanan spermler embriyoloji laboratuvarında kümülüsleri temizlenmemiş yumurtalar (COC) ile aynı kültür ortamında biraraya getirilerek spermin yumurtayı doğal olarak döllemesi beklenir.
 

Tecrübe gerekiyor


IVF uygulamasında sadece dölleme kapasitesi olan spermlerin yumurtaya girişi mümkün olduğu için doğal bir seçilim söz konusudur. Fakat bu durum, spermlerin dölleme potansiyellerinin yeterli değerlendirilmediği durumlarda yüksek oranda fertilizasyon başarısızlığına da yol açabilir. Bu nedenle IVF işlemi uygulaması için doğru laboratuvar seçimi çok önemlidir. IVF uygulamasında döllenme başarısızlığı yumurtaya bağlı sebeplerle de meydana gelebilir. Bu nedenle yaygın yaklaşım, IVF planlanan ve çok sayıda yumurta toplanan vakalarda yumurtaların bir kısmında ICSI yöntemi kullanılmasıdır. IVF işleminde yaygın uygulama oosit başına 50 bin – 100 bin arası ileri hareketli spermin oositin bulunduğu kültür ortamına inseminasyonu şeklindedir. Daha az sayıda sperm kullanımı fertilizasyon başarısızlığına, daha çok sayıda sperm kullanımı ise polispermi olarak tanımlanan, birden fazla spermin yumurtayı döllemesine yol açabilir. Bu şekilde döllenen yumurtalar genetik olarak anormal embriyo gelişimine yol açacağı için, gelişen embriyolar transfer için kullanılamaz.
 

ICSI-Mikroenjeksiyon (Intra Cytoplasmic Sperm Injection)


IVF uygulaması ile döllenme sağlama imkanı bulunmayan, sperm parametreleri (sayı, hareketlilik) düşük olan, şiddetli sperm morfolojik defektleri bulunan ya da testiküler yoldan sperm elde edilen vakalarda kullanılmak üzere geliştirilen bir yöntemdir. İlk olarak 1990 senesinde Prof. Gianpiero D. Palermo tarafından Brüksel’de başarıyla uygulanmıştır.
 

Teknik donanım gerekiyor


ICSI işleminin uygulanabilmesi için laboratuvarda belirli donanımların bulunması ve uygulayacak personelin bu konuda eğitimli ve yeterli beceriye sahip olması şarttır. ICSI işleminde kullanılan mikropipet olarak adlandırılan ve biri yumurtayı tutmak (holding pipeti) ve diğeri de spermi yumurta içerisine enjekte etmek (mikroenjeksiyon pipeti) için kullanılan pipetler, mikroskoba monte mikromanipulatör olarak adlandırılan özel bir cihaz yardımıyla kontrol edilirler. Ayrıca tüm bu düzenek, işlem esnasında zararlı olabilecek titreşimleri engellemek amacıyla antivibrasyon(titreşim önleyici) bir masa üzerinde bulundurulmalıdır.


Başarılı bir ICSI uygulaması için aşağıda belirtilen şartların sağlanması ve değişkenlerin düzenli kontrolü şarttır:
  • İşlemin mutlaka antivibrasyon masa üzerinde gerçekleştirilmesi
  • Oosit morfoloji değerlendirmesi ve en önemlisi mikroenjeksiyon için morfolojik olarak en düzgün spermlerin seçilebilmesi için inverted mikroskobun görüntü ayarlarının yeterli seviyede olması ve embriyoloğun bu ayarlarla ilgili yeterli bilgiye sahip olması
  • Mikroskobun, içerisinde ICSI uygulanacak sperm ve yumurtalar bulunan kabın yerleştirildiği, ısıtmalı cam yüzeyinin sıcaklığının uygun olması (kap içerisinde 37 C sağlayacak şekilde)
  • Yumurta ve spermlerin işlem esnasında hasar görme riskini minimize etmek için doğru pipet seçimi ve pipetlerin mikromanipülatöre doğru açılarda (mikroskop eksenine 35 derece açı yapacak şekilde) ve birbirlerine paralel olacak şekilde yerleştirilmesi
  • Eğer hidrolik mikromanipulatör sistemi kullanılıyor ise; sistemin bakım ve kontrollerinin her işlem öncesinde tekrarlanması
  • En önemlisi işlemi uygulayacak embriyoloğun tüm bu konularda yeterli bilgi, beceri, tecrübeye sahip olması
 
ICSI işlemi çok hassas bir mikrocerrahi işlemidir ve yukarıda bahsedilen şartların yeterli seviyede sağlanmaması halinde işlem sonrasında yüksek oranda fertilizasyon başarısızlığı, yumurtaların dejenerasyonu(canlılığını kaybedecek şekilde hasar görmesi), embriyo gelişimi ve kalitesinde problem gözlenmesi olasıdır.


Tedavi için başvuran erkekte aşağıda belirtilen endikasyonların bulunması halinde fertilizasyon amacıyla mutlaka ICSI yöntemi tercih edilmelidir:
  • Rutin semen analizi parametrelerinin IVF için yetersiz olması
  • Şiddetli sperm morfolojik defektleri (globozoospermi, megalo-pinhead sperm, kuyruk defekti-fibröz kılıf displazileri, total immotil sperm)
  • Spermin zona pellucida’ya bağlanmasını engelleyebilecek minimal morfolojik defektler (akrozomal şekil bozukluğu, irregüler akrozomal dağılım)
  • Ejakulatla sperm elde edilmesini engelleyen durumlar, testiküler sperm kullanımını gerektiren obstrüktif, non-obstrüktif azospermi durumları
  • Önceki denemelerinde düşük IVF/ICSI fertilizasyonu ya da total fertilizasyon başarısızlığı öyküsü
 
ICSI işleminde sadece olgun olduğu tespit edilen yumurtalar kullanılır. İşlem için bahsedilen donanım ve şartlarda, yumurta başına bir adet olacak şekilde ileri doğru hızlı hareketli ve morfolojik olarak en düzgün spermler seçilip mikroenjeksiyon pipetiyle alınır ve sperm hareketliliğini yavaşlatan bir solüsyon içerisine aktarılarak burada sperm kuyruğu pipet darbesi ile kırılır. Bu işlemin amacı sperm kuyruğunu çevreleyen tabakaya (fibröz kılıf) ve içerisindeki hücre zarına hasar vererek, sperm sitoplazması içerisindeki oosit aktivasyon faktörü olarak tanımlanan ve oositin moleküler düzeyde spermin girişini algılamasını ve döllenmeyi sağlayacak zincir reaksiyonları başlatmasını sağlayan protein yapılarının (phospholipase C) oosit sitoplazmasına çıkışını sağlamaktır. İşlemin bitiminde yumurtalar taze kültür sıvısı içerisine aktarılarak fertilizasyon kontrolüne kadar inkübasyona bırakılır.
 

Fertilizasyon Kontrolü


Fertilizasyon kontrolü IVF/ICSI işleminden 10-18 saat kadar sonra inverted mikroskop ile yapılır. Bu kontrolde biri sperm diğeri yumurtaya ait bitişik pozisyonda 2 çekirdeğin (pronükleus-PN) ve ek olarak ikinci bir kutup cisimciğinin gözlenmesi normal fertilizasyon, bu aşamadan ilk bölünmeye kadar ki gelişim aşaması zigot olarak adlandırılır. Bu sürenin geçirilmesi halinde çekirdekler birleşeceği ve görünür olmalarını sağlayan çekirdek zarı dağılacağı için döllenme olup olmadığı ya da anormal bir döllenme olmuşsa tespiti mümkün olmayacaktır.

Fertilizasyon kontrolünde çeşitli anomaliler gözlenmesi de mümkündür. Bu anomaliler:
  • MonoPN: Sadece 1 tane pronükleus gözlenmesi durumudur. Bu durumda yine de hücre bölünmesi ve embriyo gelişimi gözlenebilir; fakat gelişen embriyo yüksek olasılıkla tek gamete ait kromozom setine sahip (haploid) olacağı için anöploid (sayısal kromozom anomalili) olacaktır. MonoPN durumu ayrıca çekirdek oluşum ve silinme zamanlamalarındaki asenkroniteden de kaynaklanabilir ve bu durumda normal kromozom setine (diploid) sahip olabilir. Fakat bu durumda da gelişen embriyolarda çoğunlukla gelişim problemleri gözlenmektedir.
  • 3PN: Normalde haploid olması gereken gametlerden birinin diploid olması nedeniyle ya da mikroenjeksiyon sırasında birden fazla sperm enjekte edilmesi nedeniyle oluşabilir. Çoğunlukla embriyo gelişimi gözlense de, gelişen embriyo çok yüksek ihtimalle anöploid olacağı için transferi tercih edilmez.
  • MultiPN: 3 ve daha fazla sayıda çekirdek gözlenmesi durumudur. Embriyo gelişimi olsa dahi kesinlikle transfer edilmez.
  • Fragmented PN: Normal boyutta 2 çekirdeğin yanında bir veya daha fazla küçük çekirdeğin gözlenmesi durumudur. Çekirdeklerin birleşmesi sürecinde düzelebilir ve normal embriyo gelişimi gözlenebilir.
  • PN boyutları farklı: Çekirdeklerden birinin diğerinden farklı büyüklükte olması durumudur. Gelişen embriyolarda çoğunlukla gelişim problemleri gözlenmektedir.
  • Ayrık PN: Çekirdeklerin arasında değişen miktarlarda mesafe olması, bitişik olmamaları durumudur. Çekirdeklerin sitoplazma içerisinde pozisyonunu düzenleyen mikrotübül yapılarındaki problemlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. Aynı yapılar hücre bölünmesini de yönettiği için çoğunlukla embriyo gelişiminde problemler ya da duraksaması gözlenebilir.
 

Embriyo Kültürü


Embriyo kültürü basitçe rahim içi ortam şartlarının (in vivo) laboratuvarda oluşturulması (in vitro) ve bu suni ortamda embriyoların geliştirilmesi olarak tanımlanabilir. Bu ortam şartları;
  • Vücut sıcaklığı olan 37 derece ve kandaki seviye olan yüzde 5-6 karbondioksit oranını kontrollü olarak sağlayan inkübatörler
  • Embriyoların besin ve hücresel yapıtaşı ihtiyaçlarını karşılayacak kültür solüsyonları
  • Kültür sürecinde kontaminasyon riskini en aza indirecek steril çalışma alanları
  • Partiküller ve uçucu organik bileşiklerden temizlenmiş laboratuvar havalandırması

Bu şartların sağlanmasını ve devamlılığını kontrol edecek uzman personel şeklinde özetlenebilir. Bu konunun detaylarını "Kalite Kontrol" başlıklı yazımızda bulabilirsiniz.

Embriyo kültüründe bu amaç için özel olarak üretilmiş ve gerekli kalite kontrol testleri (MEA-mouse embryo assay, LAL endotoxin test) yapılmış hazır solüsyonlar kullanılır. Bu solüsyonların ortak noktaları, embriyoların gelişim sürecinde ihtiyaç duyacakları enerji kaynakları (piruvat, glikoz), yapıtaşları (aminoasitler), pH tamponları (bikarbonat) ve mineraller ile destekleyici bileşenleri (EDTA, albumin) içermesidir.

Genel olarak kültür sistemlerinde iki farklı yaklaşım söz konusudur. Ardışık kültür ve mono kültür. Ardışık kültür ortamı yaklaşımında, embriyoların doğal ortamında, tüplerde ve rahim içerisinde farklı ortam şartlarına maruz kaldığı ve dolayısıyla laboratuvarda da aynı değişken şartların sağlanması gerektiği savunulur (back to nature-doğaya dönüş). Mono kültür yaklaşımında ise; embriyonun gelişim sürecinde aynı kültür solüsyonu içeriğinden değişen ihtiyaçlarına göre farklı oranlarda kullanabilme yeteneği olduğu, bu nedenle solüsyon içeriğini gelişim dönemine göre değiştirmenin gereği olmadığı savunulur (let the embryo choose-bırak embriyo seçsin). Her iki yaklaşım da, kullanan laboratuvarın performansına bağlı olarak, benzer oranlarda başarılı sonuç verir.

Embriyo gelişimi döllenmiş yumurtanın (zigot) ilk bölünmeyi geçirmesiyle (20-26.saat) başlar. Bu gelişim süreci klivaj ve blastokist dönemi olarak ikiye ayrılır:
 

Klivaj Dönemi


Embriyonun 2 hücreden  (OPU’dan sonraki 1.gün), 15-20 arası sıkıca birleşmiş hücre içeren (morula) aşamaya kadar (OPU’dan sonraki 4.gün) olan gelişimi klivaj (bölünme) dönemi olarak adlandırılır. Bu dönem adından da anlaşılabileceği gibi embriyonun mitoz bölünme ile hücre sayısını arttırdığı dönemdir. Fakat görünenin dışında hücre içerisinde metabolik faaliyetler, protein sentezi ve DNA kopyalama işlemleri gerçekleştirilir. Bu dönemde gerçekleşen en önemli değişimlerden biri 8 hücre aşamasından sonra artık sperm genetik yapısının da embriyo gelişimini yönlendirmeye katılmasıdır (embriyonik genom oluşumu). Dolayısıyla sperm kaynaklı olası problemler çoğunlukla bu aşamadan sonra ortaya çıkar. Son yıllarda sürekli izleme sistemli cihazlar ile yapılan çalışmalar bu dönemdeki mitoz bölünme zamanlamalarının embriyonun ileri gelişim potansiyeli ve genetik yapısı ile ilgili bilgi verebileceğini gösteriyor.

Bu dönemde embriyo kalitesi başlıca hücre sayısı, hücrelerin birbirlerine göre boyutları ve fragmantasyon (hücre parçacıkları) varlığı ve oranına göre belirlenir. Ek olarak gözlenen olası morfolojik anomaliler (vakuol-sıvı dolu kesecik, granülasyon) embriyo kalitesini olumsuz etkileyebilirler. Buna göre klivaj dönemi embriyo kalitesi tanımlamaları aşağıdaki şekildedir:
  • Kalite: Eşit blastomer büyüklüğüne sahip, yüzde 0-5 oranında fragmantasyon içeren embriyo
  • Kalite: Eşit blastomer büyüklüğüne sahip, yüzde 5-10 oranında fragmantasyon içeren ya da blastomer boyutları hafifçe farklı, fragmantasyon içermeyen embriyo
  • Kalite: Blastomerler boyutları hafifçe farklı, yüzde 10-20 oranında fragmantasyona içeren veya blastomer boyutları ciddi oranda farklı, fragmantasyon içermeyen embriyo
  • Kalite: Blastomer boyutları ciddi oranda farklı, yüzde 10 üzerinde fragmantasyon içeren ya da blastomer sayısı net sayılamayan, yüzde 20 dan fazla fragmantasyona sahip embriyo
 

Blastokist Dönemi


Morula aşamasındaki sıkıca birleşmiş hücreler arasında sıvı dolu boşluklar (blastosöl) ortaya çıkması ile başlayan gelişim aşaması blastokist olarak adlandırılır. Blastokist dönemi, klivaj döneminden, mevcut hücrelerin artık farklı görevler için başkalaşmaya başlamasıyla ayrılır. Hücrelerin bir kısmı embriyonun çeperlerini (trofektoderm) oluşturacak şekilde yayılırken, diğer bir grup hücre blastosöl içerisinde ayrı bir sıkı paketlenmiş hücre grubu (ICM-iç hücre kitlesi) oluştururlar. Blastokistin rahime tutunması (implantasyon) sonrası fetal gelişim evresinde trofektoderm hücreleri gebelik kesesini (gestational sac) oluştururken, ICM hücreleri bebeği (fetus) meydana getirirler.

Blastokist dönemi embriyo kalitesi başlıca blastosöl hacmi ve ICM ile trofektodermdeki hücre yoğunluğuna göre belirlenir. Ek olarak gözlenen olası morfolojik anomaliler (vakuol, ayrı hücreler, dejenere hücreler) embriyo kalitesini olumsuz etkileyebilirler. Buna göre blastokist dönemi embriyo kalitesi tanımlamaları aşağıda belirtilen 3 başlık altındaki değerlendirmenin kombinasyonu ile yapılır.
 

Blastosöl hacmine göre:

  • Blastosölün oluşmaya başlaması, blastosöl hacminin embriyo hacminin yarısından az olması
  • Blastosöl hacminin embriyo hacminin yarısından fazla olması
  • Blastosöl hacminin embriyo hacminin tamamını kaplaması
  • Blastosöl hacminin embriyo hacminden büyük olması, zona’nın incelmesi
  • Zona çeperinin kırılarak embriyonun dışarı çıkmaya başlaması
  • Embriyonun tamamen zona’dan çıkması
 

ICM hücre yoğunluğuna göre:

  • Sıkı paketlenmiş çok sayıda hücre
  • Gevşek grup oluşturan az sayıda hücre
  • Çok az ya da hiç hücre olmaması
 

Trofektoderm hücre yoğunluğuna göre:

  • Pek çok sıkıca bitişik hücreden oluşan yapı
  • Az sayıda hücreden oluşan gevşek yapı
  • Çok az sayıda büyük hücreden oluşan yapı
 

Bu değerlendirmeye göre ideal blastokist kontrol zamanlamasında (IVF/ICSI sonrası 106-108.saat) en kaliteli blastokist 4AA, en düşük kaliteli olan ise 1CC olarak değerlendirilebilir. Embriyo kalite değerlendirmesi, sadece mevcut embriyolar arasında gebelik oluşturma ihtimali en yüksek embriyonun seçimini sağlamakta yardımcı olur, gebelik sonrası oluşabilecek herhangi bir komplikasyonun ya da olası genetik anormalliklerin tespiti için yardımcı olmaz. Bu gibi risklerin tespiti ve olası önlemler için ileri tetkik ve uygulamaların kullanılması gerekir.
 

AHA (Assisted Hatching-Yardımlı Tomurcuklama)


Embriyolar blastokist aşamasındayken trofekderm hücrelerinden salgılanan lizin enzimi yardımıyla zona çeperini inceltir ve yine trofektoderm hücrelerinin blastosöl içeriğindeki iyon konsantrasyonunu değiştirmesi sayesinde artan iç sıvı basıncının yardımıyla zona’yı yırtarak dışarı çıkarlar (hatching-tomurcuklanma). Embriyonun rahime tutunması (implantasyon) ancak embriyo zona’dan tamamen çıktıktan sonra gerçekleşebilir.

Bu konuda yapılan çalışmalar, embriyoların laboratuvar ortamında kültürünün ve özellikle embriyo dondurma çözme işleminin zonayı sertleştirici etkisi olduğunu ve dolayısıyla embriyonun çıkışını güçleştirdiğini gösteriyor. Ek olarak, ileri kadın yaşının ve zona tabakasında gözlenen anomalilerin de (kalın ya da düzensiz zona yapısı, ekstra iç zar-inner membrane varlığı gibi) benzer zorlaştırıcı etkiye neden olduğu düşünülüyor.

Bahsedilen olumsuzlukları aşabilmek için zona çeperinin transfer öncesi inceltilmesinin faydalı olduğu bilimsel çalışmalarla gösteriliyor. Bu amaçla tanımlanmış mekanik, kimyasal ve lazer uygulamaları tanımlanmış olmakla birlikte, içlerinde en etkin ve yaygın olarak kullanılanı lazer uygulamasıdır. Bu uygulamada, inverted mikroskoba monte edilen ve embriyoya minimum zarar verecek dozda lazer ışını sağlayan, bu işlem için özel üretilmiş cihazlar kullanılarak, hücrelere en uzak bir noktadan zona tabakasına yapılan lazer atışları ile inceltme yapılabilir. Çoğunlukla zona tabakasını yarı yarıya inceltecek ardışık 3 atışın yapılması yeterli olur. İleri derecede zona anomalilerinin mevcudiyeti halinde inceltme yerine tamamen açıklık oluşturulması da tercih edilebilir. 3 ve üzeri blastokist seviyelerinde yapılacak lazer atışları, artık zonaya çok yakın olan trofektoderm hücrelerine zarar verebileceği için, bu aşamalarda kullanımı tercih edilmez.
 

Embriyo Biyopsisi (Preimplantasyon Genetik Tanı-Tarama)


Tüp bebek tedavilerinde embriyo biyopsisi, preimplantasyon (embriyonun transferi ve rahime tutunması öncesi) dönemde, genetik olarak normal, sağlıklı embriyoların seçimi amacıyla uygulanan bir tekniktir. Endikasyonlarına göre iki tür genetik test yaklaşımı uygulanır.

Preimplantasyon genetik tarama (PGS-Preimplantation Genetic Screening), kadın ve erkekte ya da ailelerinde bilinen bir genetik hastalık bulunmayan çiftlerin embriyolarında bulunan olası de-novo (sperm ya da yumurtadan kaynaklanan ve ilk kez embriyoda ortaya çıkan) mutasyonları (DNA anormallikleri) saptamak için kullanılır.

Preimplantasyon genetik tanıda (Preimplantation Genetic Diagnosis) kadın ya da erkekten birinde ya da ailelerinde mevcut, bilinen bir genetik ve kalıtsal hastalığın bebeğe geçişini engellemek amacıyla bu hastalığa sahip olmayan embriyoların belirlenmesi amaçlanır. Bu genetik testlerin uygulandığı endikasyonlar ve uygulama aşamalarının seçimi ile ilgili “Genetik” başlıklı bölümü inceleyebilirsiniz.

Her iki test yaklaşımının uygulanabilmesi için öncelikle tüp bebek yöntemi (KOH) uygulanması ve başarı şansını arttırabilmek için mümkünse çok sayıda embriyo elde edilmesi gerekir. Tedavi sürecinde biyopsi, test endikasyonlarına göre 3 farklı aşamada uygulanabilir. Tüm biyopsi işlemleri, mikromanipulator donanımlı inverted mikroskoplarda ve biyopsi türüne uygun olarak üretilmiş mikropipetler kullanılarak uygulanır.
 

Kutup Cisimciği Biyopsisi-PBB(Polar Body Biopsy)


Yumurta toplama (OPU) işleminin yapıldığı gün uygulanır. Yumurtaya ait birinci ve bazı durumlarda her iki kutup cisimciği biyopsi ile alınır. 1.kutup cisimciği mikroenjeksiyon işleminden hemen önce, her iki kutup cisimciği alınacaksa ardışık olarak ya da mikroenjeksiyondan en geç 8 saat kadar sonra birlikte alınabilir. İnverted mikroskopta, lazer kullanılarak yumurtaların kutup cisimciklerine yakın bir bölgesinde zona tabakasına 3-6 atış yapılarak açıklık oluşturulur ve buradan biyopsi pipeti ile girilerek kutup cisimcikleri aspire edilir. İşlem sürecinde ortam pH'sının etkilenmemesi için HEPES tamponlu kültür sıvısı içerisinde gerçekleştirilir ve işlemin bitiminde yumurtalar taze kültür sıvısına aktarılarak inkübatöre kaldırılır.
 

Blastomer Biyopsisi


Embriyo gelişiminin 3.gününde, 7 ve üzeri hücre içeren embriyolardan bir tane hücre biyopsi ile alınır. Daha az sayıda hücre içeren embriyolara uygulanması ya da birden fazla hücre alınması ileri embriyonik gelişimi olumsuz etkiler. İnverted mikroskopta, lazer kullanılarak çekirdek içerdiği tespit edilen ve biyopsi için seçilen hücreye yakın bir bölgeden zona tabakasına 3-6 atış yapılarak açıklık oluşturulur ve buradan biyopsi pipeti ile girilerek hücre aspire edilir. İşlem hücreler arasındaki bağları zayıflatmak ve böylece biyopsi esnasında zarar görmelerini engellemek amacıyla kalsiyum ve magnezyum içermeyen HEPES tamponlu özel bir sıvı içerisinde uygulanır. İşlemin bitiminde yumurtalar taze kültür sıvısına aktarılarak inkübatöre kaldırılır.
 

Trofektoderm Biyopsisi


Embriyo gelişiminin 5. ve bazı durumlarda 6.gününde blastokist aşamasındaki embriyolara uygulanır. İşlemin uygulanabilmesi için trofektoderm hücrelerinin bir kısmının zona tabakasından dışarıya çıkmış olması (hatching-tomurcuklanma) gerekir. Bunu sağlamak amacıyla embriyo gelişiminin 3.gününde, biyopsi yapılması planlanan embriyoların zona tabakasında, hücrelere uzak bir bölgeden 3-6 atış yapılarak açıklık oluşturulur. 5.günde bu açıklıktan dışarı çıkan hücreler biyopsi pipeti ile tutularak, mekanik olarak ya da kesilmesi planlanan bölgeye yapılan lazer atışları ile 5-6 hücre içeren bir parça alınır. Trofektoderm biyopsi sonrasında genetik laboratuvarından sonuç alınması1 gün kadar sürer. Bu süreçte blastokistlerin bekletilmesi ve 6.gün geç saatlerde transferi gebelik şansını azaltacağından, trofektoderm biyopsi uygulanan embriyoların işlemden hemen sonra dondurulması ve normal embriyo bulunması halinde 1-2 ay kadar sonra planlanacak bir çözme denemesinde transferi tercih edilebilir.
 

Embriyo Transferi


Embriyo transferi işleminde en önemli aşama, mevcut embriyolar arasında en yüksek gebelik oluşturma potansiyeline sahip embriyo/embriyoların, transfer gününün ve hekim ile işbirliği içerisinde, her bir hastaya özel olarak, transfer edilecek embriyo sayısının doğru belirlenmesidir. Ülkemizde transfer edilecek embriyo sayısı Sağlık Bakanlığı tarafından yayınlanan ÜYTE Yönetmeliği ile sınırlandırılmıştır. Buna göre, kadın yaşı 35'in altında olan vakalarda 3. denemeye kadar 1 embriyo transferi, 3.deneme ve sonrasında en fazla 2 embriyo transferi, kadın yaşı 35 ve üzeri olan vakalarda ise en fazla 2 embriyo transferi uygulanabilir. Bu durum, bu konuda bilinçli merkezler ve hastalar bakımından bir fark yaratmamaktadır; çünkü zaten tekiz gebeliğe kıyasla, elde edilmiş bir gebeliğin kaybı (düşük), gebelik sürecinde oluşabilecek birçok komplikasyon ve erken doğum ihtimali bakımından çok daha riskli olan çoğul gebeliklerden kaçınmak her merkezin tıbbi ve etik sorumluluğudur.

Uygun laboratuvar şartlarının varlığı halinde elde edilen iyi kalitede 1 embriyonun transferi ile 2 embriyo transferine çok yakın canlı doğum oranlarına ulaşmak mümkündür. Bu karşılaştırmayı canlı doğum oranları üzerinden yapmak en doğru yaklaşımdır; çünkü ikiz gebelik sonucu gerçekleşen çoğul gebeliklerde karşılaşılan komplikasyonlar nedeniyle, elde edilen gebeliğin canlı doğuma ulaşma oranı tekiz gebeliklere kıyasla daha düşüktür.

Transfer edilecek embriyoların doğru seçilebilmesi için embriyoloji laboratuvarında, kullanılan sperm ve yumurtadan başlayarak, transfer gününe kadar tüm inceleme ve değerlendirmelerin günlük olarak eksiksiz şekilde yapılması ve kaydedilmesi çok önemlidir. Böylece, sadece transfer günü embriyo kalitesi gibi tek bir parametreye bağlı olarak değil, embriyoları oluşturan sperm ve yumurtaların kalitesi ile birlikte, embriyoların günlük gelişim hızları, bölünme şekilleri ve kaliteleri de kümülatif olarak değerlendirilerek en doğru embriyoların seçimi sağlanabilir.

Transfer günü ve transfer edilecek embriyo sayısı, birçok parametrenin dahil edilmesi gereken ve çoğul gebelik ihtimalini düşük tutarken, sağlıklı bir gebelik şansını mümkün olan en yüksek seviyede hedefleyerek verilmesi gereken çok önemli bir karardır. Bu parametreler şunlardır:
  • Sperm ve yumurta kalitesi
  • Mevcut embriyo sayısı ve kalitesi
  • Kadın yaşı
  • Kadınla ilgili klinik değerlendirme
  • Varsa önceki deneme öyküsü
  • Varsa önceki gebelik/düşük öyküsü
  • Varsa ailede çoğul gebelik öyküsü
  • Pgt uygulanmış olup olmadığı
  • Hasta beklentisi
Transfer günü ile ilgili kararda dikkate alınması gereken, embriyonik gelişim ile ilgili önemli bir parametre vardır. Sperm DNA'sının embriyo gelişiminin yönetimine katılması (embriyonik genom oluşumu), gelişimin 3.günü (8 hücre aşamasına geçiş) gerçekleşir. Dolayısıyla, sperm DNA yapısındaki hasarlardan kaynaklanabilecek olası bir olumsuzluk; ancak bu aşamadan başlayarak ortaya çıkmaktadır. Ortalama olarak zigotların yüzde 30-35, 3.gün gelişen embriyoların ise yüzde 55-60 kadarı 5.gün blastokist aşamasına ulaşabilir. Bu düşüşte yumurta kalitesine ek olarak spermin rolü büyüktür. Bu nedenle, özellikle 3.günde, transfer için planlanan sayıdan daha fazla sayıda kaliteli embriyosu olan vakalarda, doğru embriyo seçimi için 4. ya da 5.günün beklenmesi en doğru tercihtir. Diğer taraftan, 3. günde zaten transferi planlanan sayıda kaliteli embriyosu olan vakalarda ise ileri günlerin beklenmesi gereksizdir. 4. ya da 5. günün beklenmesi, 3. gün az sayıda ve düşük kalitede embriyosu bulunan ve ileri gelişimine devam edeceği şüpheli vakalarda da, sonuç vermeyecek gereksiz bir transferin önüne geçmek adına önemlidir.

Transfer işleminde hasta ve hekim hazır olduğunda, seçilen embriyolar embriyolog tarafından bu işlem için özel olarak üretilmiş kateter içerisine yüklenerek, transferi gerçekleştirilecek hekime teslim edilir. Bu yükleme esnasında ideal yöntem aşağıdaki figürde de görüleceği şekilde, embriyonun iki küçük hava boşluğu içerisinde çok az kültür sıvısı (yaklaşık 5 mikrolitre) ile yüklenmesidir. Böylece hem transfer esnasında embriyoların kontrollü bir şekilde rahime bırakılması hem de hava kabarcıkları ultrasonda izlenerek embriyonun bırakıldığından emin olunması mümkün olur. Hava boşlukları aynı zamanda embriyonun kateter içerisine yapışıp kalmasını da engellenir. Ayrıca bu sayede embriyo ile birlikte transfer edilen kültür sıvısı miktarı minimumda tutularak, transfer sonrasında sıvının akışı ile embriyonun yer değiştirmesi de büyük oranda engellenmiş olur.
 

Embriyo Dondurma


Embriyo dondurma işlemi hakkında bilgi almak için "Dondurma İşlemleri" başlıklı bölümü inceleyebilirsiniz.